背景及概述[1]
随着酪氨酸激酶抑制剂（tkis）的研发应用，慢性髓细胞白血病（cml）和城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（ph+all）患者的临床结局较前明显改善。甲磺酸伊马替尼是全球首个批准上市的代tkis，能特异性阻断腺苷三磷酸（atp）在abl激酶上的结合位置，使酪氨酸残基不能磷酸化，从而抑bcr-abl蛋白活性，导致bcr-abl阳性细胞增殖受抑、凋亡增加。这种针对发病机制的分子靶向治疗使cml和ph+all患者的预后发生了巨大改变。然而，接近35%的cml患者接受伊马替尼治疗并未获得完全细胞遗传学缓解（ccyr），可能是这部分患者复发的主要原因。第二代tkis（如达沙替尼和尼洛替尼）可改善伊马替尼治疗失败患者的疗效，延长总生存期。目前，达沙替尼、尼洛替尼都已被批准作为cml慢性期患者的一线治疗方案。尽管代、二代tkis改善了cml及ph+all患者的临床结局，但耐药仍发生在一些bcrabl突变患者中，尤其是t315i突变。在普纳替尼(普拉替尼)（ponatinib）获批之前，市场上没有tkis能克服这些bcr-abl突变患者耐药、难治或不耐受的情况。针对t315i突变，ariad制药公司研制了第三代tkis———普纳替尼(普拉替尼)。普纳替尼(普拉替尼)与bcrabl激酶位点结合的独特作用机制，可抑制含t315i突变在内的bcr-abl激酶活性，为cml及ph+all患者带来了新的希望。普纳替尼(普拉替尼)曾用名ap24534，化学名为3-（2-咪唑[1，2-b]哒嗪-3-乙炔基）-4-甲基-n-[4-[（4-甲基-1-哌嗪基）-甲基]-3-（三氟甲基）]甲酰胺，相对分子质量：532.56，分子式为c29h27f3n6o。
作用机制[1]
普纳替尼(普拉替尼)是一种口服多靶点tkis合成物，为pan-bcr-abl抑制剂。其体外抑制abl与t315i突变abl酪氨酸激酶活性的半抑制浓度（ic50）分别为0.4、2.0nmol·l-1，ic50值在0.1～20nmol·l-1，亦抑制其他致癌激酶的活性，包括血管内皮生长因子受体（vegfr）、血小板衍生生长因子受体（pdgfr）、纤维母细胞生长因子受体（fgfr）、生促红素人肝细胞（eph）受体、胞质酪氨酸激酶src家族（sfk）、酪氨酸激酶膜受体基因（c-kit）、孤儿受体酪氨酸激酶（ret）、促血管生成素ⅰ型酪氨酸激酶受体2（tie2）和fms样的酪氨酸激酶3（flt3）。普纳替尼(普拉替尼)的分子结构是根据与t315i相互作用的不同方式设计，与现有激酶抑制剂结构无关。abl抑制剂包括含天冬氨酸-丙氨酸-甘氨酸（dfg-in，1类抑制剂）和不含天冬氨酸-丙氨酸-甘氨酸（dfg-out，2类抑制剂）两种类型，这取决于它们与bcr-abl相互作用的结合方式。1类抑制剂为代小分子激酶抑制剂，靶向作用于酶活化基团的atp结合位点，以活化环的构型开放为特征；2类抑制剂与其他疏水位点结合，与1类抑制剂不同，形成构型失活。相比之下，2类抑制剂较1类有更高的选择性和疗效。
1类抑制剂包括舒尼替尼、达沙替尼，2类抑制剂包括伊马替尼、尼洛替尼和普纳替尼(普拉替尼)。不论结合方式，伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼都会与野生型abl的门控基因残基thr315侧链形成一个关键氢键，亦含部分亲脂性，与位于thr315附近的疏水袋结合。但这种氢键易受破坏，且门控基因残基突变成异亮氨酸亦引起空间位阻，限制抑制剂结合临近的thr315疏水袋。因此，伊马替尼、达沙替尼和尼洛替尼不能抑制thr315点突变的abl激酶活性。临床上观察到15%~20%的患者出现t315i突变，这种高度耐药变异发生在bcr-abl融合蛋白abl激酶atp结合位点的门控基因区。值得注意的是，普纳替尼(普拉替尼)能避开与野生型bcrablt315i的侧链结合，形成有利于结合t315i突变侧链异亮氨酸的范德华引力。此外，普纳替尼(普拉替尼)亦能调节异亮氨酸突变体的空间位阻，与t315i点突变结合抑制abl激酶活性。
体外研究显示，普纳替尼(普拉替尼)对敏感与耐药cml细胞株均有明显的增殖抑制作用，且无论野生型bcr-abl还是t315i突变都有效。此外，普纳替尼(普拉替尼)还具有抗伊马替尼耐药突变体（kit及pdgfrα）及抗fgfr1-4、flt3活性的作用[fgfr1-4、flt3与骨髓增生异常综合征（mds）、急性髓细胞白血病（aml）等其他恶性血液肿瘤的发生有关，能有效阻止t细胞激酶lck的异位表达（lck是一种原癌基因，在细胞中的异位表达可以诱发细胞癌变），但对内源性fyn、src影响不大。
临床研究[1]
1. 抗cml
伊马替尼对bcr-abl融合蛋白酪氨酸激酶活性的抑制作用，在许多cml患者治疗中起到了持久的应答效应，但出现酪氨酸激酶分子结构突变可导致耐药和疾病复发，即使换用或首选第二代tkis治疗，t315i及其他复合突变引起的交叉耐药问题仍是当前cml治疗面临的一个主要挑战。针对难治性cml中的各bcr-abl突变与耐药情况，以t315i突变为靶点的第三代tkis产生了，主要的临床研究药物就有普纳替尼(普拉替尼)。体外活性实验显示，普纳替尼(普拉替尼)能抑制小鼠t315i突变起源的肿瘤生长，完全消除耐药的bcr-abl突变细胞，具有抗野生型bcr-abl及t315i突变体的活性。此外，还有报道cml患者中新发现的两种bcr-abl突变体（l248r、t315v），对当前批准上市的代、二代tkis均高度耐药，而对普纳替尼(普拉替尼)仅轻中度耐药。ⅰ期临床试验纳入了60例cml耐药患者（43%处于慢性期，20%有t315i突变，91%已使用两种以上的tkis药物），研究发现普纳替尼(普拉替尼)每日口服耐受的剂量范围为2～60mg，中位随访56周，常见的不良反应包括皮疹、骨髓抑制，剂量限制性毒性反应包括血脂肪酶或淀粉酶升高甚至胰腺炎。疗效分析显示，普纳替尼(普拉替尼)对cml患者有持久的治疗效果，慢性期患者中98%～100%达完全血液学缓解（chr）、72%达主要细胞遗传学缓解（mcyr）、44%达主要分子生物学缓解（mmr），t315i突变患者中100%达chr、92%mcyr，加速期与急变期患者中36%达chr、32%达mcyr。由此推测，普纳替尼(普拉替尼)是一种强有效的口服tkis，能封锁野生型与突变型bcr-abl（包括t315i）融合蛋白的酪氨酸激酶活性，抑制bcr-abl阳性细胞增殖从而发挥抗肿瘤作用。对于难治性的cml患者，尤其有t315i突变的患者来说，该药的临床应用将带来一种突破性进展。
2. 抗all
ph染色体见于20%～30%的成人all患者，其预后比ph-all更差。近年来，由于tkis联合化疗方案的推广，ph+all患者的预后有所改善，但耐药与疾病复发率高仍是当前临床治疗比较棘手的问题。thomas[21]报道ph+all常发生t315i突变，即使换用第二代tkis治疗，交叉耐药依旧不可避免。研究纳入了5例难治性ph+all患者，均对当前一代和二代tkis耐药，结果显示普纳替尼(普拉替尼)治疗有效且作用持久，患者100%达chr、92%达mcyr。这预示普纳替尼(普拉替尼)很可能成为难治性ph+all患者的佳治疗选择。
3. aml
在aml患者中，flt3突变常见，且预后不良。近年来，flt3-itd突变成为小分子抑制剂靶向治疗中一个很有希望的靶点，flt3抑制剂（ac220-奎扎替尼、索拉非尼等）的出现就是很好的例证。但对于二次flt3点突变，上述flt3-tki中度耐药。普纳替尼(普拉替尼)作为新一代bcrabl抑制剂，不仅具有较强的抗bcr-abl突变体（包括t315i）活性，也有抗flt3作用。对转染flt3-itd、flt3-tkd的鼠骨髓细胞研究显示，普纳替尼(普拉替尼)可以有效地诱导原代flt3-itd细胞系flt3-tkd点突变细胞发生凋亡。体外活性实验中，用普纳替尼(普拉替尼)处理ac220-奎扎替尼、索拉非尼耐药的aml细胞，结果发现flt3（f691l突变）轻度耐药，flt3（d835突变）高度耐药。因此，普纳替尼(普拉替尼)作为有应用前景的新一代flt3-tki，进一步的临床试验研究有待开展。多柔比星作为aml常用的一种主要化疗药物，其主要不良反应有心脏毒性、乏力等，这和mapk调控zak相关炎症因子的释放有关。此外，对白血病多重耐药相关atp结合盒式（atp-bindingcassette，abc）蛋白的研究显示，普纳替尼(普拉替尼)通过增加abcb1、abcg2作用底物的吸收（但不影响abcc1），从而有效抑制[（125）i]-iaap与abcb1、abcg2蛋白连接，细胞耐药在一定程度上得以减轻，与柔红霉素、米托蒽醌等药物产生协同作用，可促进细胞凋亡。这两项研究启示我们，普纳替尼(普拉替尼)可减低多柔比星的不良反应，对其他蒽环类化疗药物也可能有类似作用，与化疗药物产生协同效应。所以，联合使用普纳替尼(普拉替尼)和化疗药物的效果和安全性有待进一步探索。
4. mds
mds8p11是一种罕见的侵袭性骨髓增生性疾病，以fgfr1融合蛋白阳性为特征，其产生源于一种特殊的染色体异位（8p11），具有持续活性，可导致细胞异常增殖。尽管fgfr1抑制剂在体外呈现了抗fgfr1融合蛋白活性的作用，但目前尚无药物应用于临床，这就促使评估其他药物是否存在此种潜在的治疗效应。实验中，以ba/f3细胞系和原代细胞（fgfr1阳性）为研究对象，结果显示普纳替尼(普拉替尼)能减少ba/f3细胞的增殖，可一定程度上消除残存的细胞，亦减少原代细胞中细胞群体的生长发育，尤其是fgfr1阳性细胞群体的数目明显减少。提示对于难治性mds8p11患者，普纳替尼(普拉替尼)是一个非常有希望用于其治疗并改善预后的药物。
5. 抗干细胞白血病/淋巴瘤综合征（scll）
scll为髓、淋系细胞恶性增殖性疾病，起病多与fgfr1的异常表达有关，以具有持续的fgfr1激酶活性为特征，可迅速转变为aml和淋巴瘤，预后极差。目前分子靶向治疗尚未广泛用于scll的治疗，普纳替尼(普拉替尼)作为新一代的bcr-abl抑制剂，也作用于fgfr家族。在ren等[27]对鼠baf3细胞的研究中，发现该药能有效抑制fgfr1融合激酶及其下游效应器（如plcy、stat5、scr等）的磷酸化作用，特异性地抑制镶嵌体fgfr1融合激酶cd34+祖细胞的细胞生长及集落生成，并显著延长scll细胞系成瘤小鼠的生存期，按30mg·kg-1剂量亦能明显延迟甚至抑制鼠kg1细胞的肿瘤再生。这些结果提示普纳替尼(普拉替尼)对fgfr1融合激酶的抑制作用很可能有益于scll患者的治疗，以及其他与fgfr1异常表达活化相关的人类疾病。
6. 抗其他fgfr起源的恶性肿瘤
普纳替尼(普拉替尼)是种多靶点激酶抑制剂，近几年多个研究发现其能强有力地抑制fgfr1-4家族融合激酶活性。鼠ba/f3细胞诱导fgfr1-4激酶表达活化实验中，普纳替尼(普拉替尼)（ic50<40nmol·l-1）有效地抑制了fgfr介导的信号通路，在一组以子宫内膜癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌为代表的14种细胞系研究中（包含了各种机制引起的fgfrs异常表达），普纳替尼(普拉替尼)（ic50为7～181nmol·l-1）亦能通过抑制fgfr介导的信号调节通路来抑制肿瘤细胞的生长。以子宫内膜癌患者为研究对象，发现普纳替尼(普拉替尼)与哺乳动物雷帕霉素（mtor）抑制剂ridaforalimus联合使用能同时抑制fgfr2、mtor，发挥双重通路调控作用，从而抑制肿瘤生长，这为高危子宫内膜癌患者提供了一种新的治疗策略。上述结果提示我们普纳替尼(普拉替尼)是一种有效的fgfr抑制剂，可考虑用于治疗fgfr起源的恶性肿瘤性疾病。
制备[1]
1）3-溴代咪唑并［1，2-b］哒嗪(3)的制备
将200g(1.68mol)咪唑并［1，2-b］哒嗪(2)溶于2l氯仿中，加328.8g(1.85mol)n-溴代丁二酰亚胺，加热回流(61℃)过夜，tlc显示反应完全。有机相用水洗涤(1l×2)，饱和氯化钠溶液洗涤(1l×1)，无水钠干燥，旋干溶剂得321g浅黄色固体3，收率96.7%，mp145～147℃(文献：mp146～147℃)。msm/z：197.9［m+h］+。
2）4-甲基-3-三甲基硅基乙炔基甲酸甲酯(5)的制备
在5l三颈瓶中依次加入3-碘-4-甲基甲酸甲酯(4)300g(1.09mol)、碘化亚2.06g (11mmol)、二(三基膦)二氯化钯7.63g(11mmol)、4l、三乙胺329.3g(3.25mol)、三甲基硅乙炔159.8g(1.63mol)，通入氩气置换体系中的气体，封闭反应体系，室温搅拌过夜，tlc检测反应完全。过滤反应液，滤液用水(1l×2)、饱和氯化钠溶液洗涤(1l×1)，无水钠干燥，旋干溶剂得267.4g红色固体5，收率99%，无需纯化直接用于下步反应。
3）3-乙炔基-4-甲基甲酸甲酯(6)的制备
在5l三颈瓶中，加入267.4g(1.09mol)化合物5，再加入4l甲醇，机械搅拌使其溶解，加入225g(1.63mol)碳酸钾，室温机械搅拌的同时tlc监控反应(每1min1次)进程，约5～10min反应完毕。将反应液倾入5l水中，搅拌均匀，过滤沉淀，用3l水洗涤一次，固体真空干燥，得到180g棕色固体6，收率95%，mp62～64℃。
4）3-(咪唑［1，2-b］哒嗪-3-乙炔基)-4-甲基甲酸甲酯(7)的制备
在5l三颈瓶中加入180g(1.03mol)化合物6、198g(1.01mol)化合物3、1.9g(10mmol)碘化亚铜、7g(10mmol)二(三基膦)二氯化钯、3ln-甲基吡咯烷酮(nmp)、193.4g(1.50mol)二异丙基乙基胺(diea)，通入氩气置换体系中的气体，70℃下机械搅拌过夜，tlc检测反应完全。将反应液倾入12l水中，搅拌均匀，过滤，所得固体干燥后加入1l，搅拌1h。过滤，用洗涤(200ml×2)滤饼，真空干燥得到灰褐色固体283g；用4l溶解该固体，加入38g活性炭，加热回流1h，趁热过滤，滤液静置析晶，得185g浅黄色晶体7，收率63.6%，mp141～143℃。
5）普纳替尼(普拉替尼)(1)的合成
在2l三颈瓶中，加入50g(0.18mol)4-((4-甲基哌嗪-1-基)亚甲基)-3-三氟甲基胺(8)、53.3g(0.18mol)化合物7、500ml四氢呋喃，机械搅拌，冷却至0℃，在机械搅拌条件下缓慢滴加到由123g(1.10mol)叔丁醇钾溶于500ml无水thf的溶液中，滴加完毕后维持低温10min，移至室温，搅拌过夜，tlc检测反应完全。将反应液倾入3l水中，搅拌均匀，(1l×3)萃取，合并有机相，用水(1l×3)洗涤，无水钠干燥，旋干溶剂，得黄色固体，加入100ml溶解该固体，搅拌2h。过滤，干燥，用1，4-二氧六环-水(体积比1∶1)重结晶，得到浅黄色固体普纳替尼(普拉替尼)(1)73g，收率71.9%，mp195～197℃。msm/z：533.3［m+h］+。hplc(面积归一化法)检测纯度为99.65%。
主要参考资料
[1] 第三代bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂普纳替尼(普拉替尼)
[2] 抗白血病新药普纳替尼(普拉替尼)的合成
